ВЫПУСК 86

Новая методика изучения влияния наночастиц на здоровье и экологию

Профессор Дэвид Крам (David Cramb) из Университета Калгери (University of Calgary) сделал шаг на пути к решению сложной проблемы, связанной с нанотехнологиями - влиянию наночастиц на здоровье человека и окружающую среду.

Крам и его коллеги разработали методику изучения различных аспектов влияния наночастиц, находящихся в системе кровообращения куриных эмбрионов. Статья об их разработке опубликована в журнале Chemical Physics Letters.

«В связи с мощным развитием наноматериалов возрастает вероятность их влияния на окружающую среду и здоровье человека. Поэтому возникает необходимость исследовать потенциальные негативные эффекты. Мы разработали очень специализированный инструмент для начала изучения таких влияний», - говорит Крам.

Наночастицы – это частицы, состоящие из групп атомов или молекул размером в несколько нанометров. Один миллиметр (диаметр булавочной головки) равен одному миллиону нанометров. Наночастицы уже используются в косметической промышленности, в медицине в качестве систем доставки лекарств и диагностических контрастных веществ, в тканевой биоинженерии и во многих других областях. К 2012 году общие вложения в развитие нанотехнологий во всем мире составят 12 триллионов долларов США.

Крам ищет пути ответа на вопросы: влияют ли наночастицы на эмбрион, в какие ткани они попадают, как эмбрион реагируют на них, какие подходы могут быть предложены для смягчения случайного воздействия, как можно сделать нанотехнологии «зелеными» и безопасными.

«В нашей лаборатории проводится изучение биоаккумуляции наночастиц, включая эмбрионы», - говорит Крам. «Такие исследования очень важны, так как хроническая интоксикация наночастицами во взрослом состоянии может оказаться связанной с их воздействием в период развития. Кроме того, такое воздействие может оказать влияние и на жизнеспособность эмбриона».

Крам и его сотрудники изучают движение и вызванные светом изменения в наночастицах с помощью лазерного луча, сфокусированного на содержащие наночастицы кровеносные сосуды, и измерения флуоресценции. Эксперименты предполагают определение агрегации наночастиц в сосуде. Это уникальная методика, так как она еще не использовалась на живых эмбрионах. Результаты позволят измерить и понять поступление наночастиц в эмбриональные ткани.

По материалам University of Calgary.

Оригинал статьи

Vigilance needed in nanotechnology

Нанотехнологии выявляют молекулярные основы сердечной недостаточности

Используя технологию сканирования на наноуровне, разработанную в Имперском Колледже Лондона (Imperial College London), ученые смогли в мельчайших деталях увидеть, как сердечная недостаточность влияет на поверхность отдельных клеток сердечной мышцы. Исследование может привести к разработке более совершенных бета-блокаторов, лекарственных препаратов, способных замедлить развитие сердечной недостаточности, и к усовершенствованию современных терапевтических подходов к лечению сердечной недостаточности и аритмий.

Сердечная недостаточность – серьезное прогрессирующее состояние, при котором сердце неспособно обеспечить адекватный кровоток для удовлетворения нужд организма. Такие гормоны, как адреналин, активируемые организмом в попытке стимуляции ослабленного сердца, в конечном итоге приводят к дальнейшему ухудшению состояния. Симптомами сердечной недостаточности являются одышка, усталость, отек ног.

В новом исследовании, опубликованном в журнале Science и профинансированном Wellcome Trust и Leducq Foundation, ученые смогли проанализировать отдельные части поверхности клетки сердечной мышцы с беспрецедентной детализацией, использовав наномикроскопию.

Они применили новую технологию, называемую сканирующей ионную проводимость микроскопией (scanning ion conductance microscopy - SICM), дающую изображение поверхности клетки сердечной мышцы на более детальном уровне, чем это возможно с помощью обычной микроскопии. Это позволило ученым увидеть тонкие структуры, такие как передающие электрические сигналы в ядро клетки. Они также обнаружили, что при сердечной недостаточности поверхность клеток сердечной мышцы сильно повреждена.

Существуют два вида рецепторов адреналина. Первый, бета1AR, значительно стимулирует сердечную деятельность, но в долгосрочной перспективе также наносит вред сердечным мышцам. Второй, бета2AR, стимулирует сокращения слабее, но имеет определенные защитные свойства. В своем исследовании ученые объединили SICM с новыми химическими датчиками, дающими флуоресцентные сигналы при активации бета1AR- и бета2AR- рецепторов.

Они обнаружили, что в норме бета2AR-рецепторы располагаются на поверхности трубчатых структур, но при сердечной недостаточности они меняют свое расположение и находятся там же, где бета1AR. Ученые считают, что такое изменение расположения может оказать отрицательное влияние на бета2AR-рецепторы, снизить их способность защищать клетки и привести к ускоренной дегенерации сердечной мышцы.

Одной из наиболее эффективных групп лекарственных препаратов, замедляющих развитие сердечной недостаточности, являются бета-блокаторы, которые препятствуют связыванию влияющего на сердечные клетки адреналина с бета-рецепторами. Новое открытие углубляет понимание того, что происходит с обоими рецепторами, и может помочь в создании улучшенных бета-блокаторов. В конечном итоге это может привести и к завершению ведущейся сейчас дискуссии о том, блокада каких рецепторов – бета1AR или бета2AR – более эффективна.

Доктор Джулия Горелик (Julia Gorelik) из Национального института сердца и легких Имперского колледжа Лондона (National Heart and Lung Institute at Imperial College London) говорит: «Наша новая технология означает, что мы можем получить реальное представление о том, как при сердечной недостаточности повреждаются отдельные клетки. Используя наномикроскопию на живых клетках, мы можем сканировать поверхность клеток сердечной мышцы с гораздо большей точностью, чем это было возможно раньше, и видеть мельчайшие структуры, оказывающие воздействие на функции клеток».

«Понимая, что происходит в таком масштабе, мы сможем в конечном итоге представить детальную картину того, что происходит с сердцем при сердечной недостаточности, и, в долгосрочной перспективе, победить болезнь. Главным вопросом наших будущих исследований будет понимание того, могут ли лекарственные препараты предотвратить перемещение бета2AR-рецепторов в клетке и как это может помочь нам в борьбе с сердечной недостаточностью», - добавляет доктор Горелик.

В экспериментах использовались культуры отдельных клеток сердечной мышцы, взятых у здоровых и больных сердечной недостаточностью крыс. Ученые стимулировали бета1AR- и бета2AR-рецепторы лекарственными препаратами, вводимыми с помощью нанопипетки в трубчатые структуры на поверхности клетки сердечной мышцы.

По материалам Imperial College London.

Оригинал статьи

Detailed Insight Into Failing Heart Cells Gained Using New Nano Technique

Вглубь живой материи

Ученые раскрыли секрет высвобождения энергии молекулы АТФ

Исследователи из Центра наук о здоровье Государственного университета Луизианы (Louisiana State University Health Sciences Center) выяснили, как распадается в клетке молекула АТФ, впервые получив четкую картину ключевой реакции, позволяющей функционировать клеткам всех живых организмов.

Открытый около 80 лет назад аденозинтрифосфат считается вторым по биологической значимости веществом, уступая только ДНК. В каждой клетке человеческого организма содержится около 1 миллиарда молекул АТФ, и энергия, получаемая в результате их распада, используется клеткой для доставки различных веществ к местам их назначения, построения необходимых молекулярных комплексов и даже для работы мускулатуры.

АТФ - топливо жизни. «Эта молекула – энергетическая валюта клетки, самый важный источник химической и механической энергии в живых системах», - объясняет адъюнкт-профессор Суньянь Ким (Sunyoung Kim), курировавший исследование, опубликованное в Journal of Biological Chemistry.

Ученые десятилетиями пытались понять эту важнейшую реакцию, но до сих пор не знали, как клеточные белки извлекают и используют энергию АТФ.

В своей первоначальной форме молекула АТФ имеет три фосфатные группы. Хотя было давно известно, что для того, чтобы произошел разрыв молекулы АТФ, его третья фосфатная группа должна вступить во взаимодействие с гидроксильным радикалом – молекулой воды, лишенной одного протона – никто не знал, что же фактически лишает молекулу воды этого протона и приводит к высвобождению запаса энергии АТФ.

Для своего исследования ученые выбрали одно конкретное семейство белков – кинезины.

Кинезины – мельчайшие биологические машины, работающие подобно автомобильным моторам, говорит Ким, передвигающиеся туда и обратно по клеточным сетям из микротрубочек для поддержания ряда функций, например, таких, как деление клетки и перенос грузов.

«Мы выбрали кинезины, потому что это простейшие из известных белковых моторов. Обычно белки, разрывающие АТФ, отличаются большими размерами и имеют значительное количество мобильных частей для осуществления механической работы», - объясняет Ким. «Чем меньше и проще система, тем больше шансов получить о ней более детальную информацию».

Ученые еще более сузили сферу своего исследования и остановились на человеческом кинезине Eg5, важном для деления клеток – нормального и атипичного, и рассматриваемом в качестве привлекательной модели для создания противораковых препаратов следующего поколения. Ингибирование кинезина Eg5 путем выключения его способности разрывать молекулу АТФ может заблокировать прогрессию рака, и некоторые из Eg5-ингибиторов уже проходят клинические испытания.

«Чтобы получить ясную картину взаимодействие кинезина и АТФ, мы использовали рентгеновскую кристаллографию для создания 3-D модели, которая бы детализировала все связи и атомные взаимодействия», - объясняет профессор и один из авторов исследования Дэвид Вортилейк (David Worthylake).

Целью, однако, являлось «захватить» белок в середине цепочки событий, приводящей к высвобождению энергии, путем замены АТФ молекулой, хотя и имитирующей ее, но имеющей последнюю фосфатную группу, которую нельзя удалить как обычно, и детально исследовать «застрявший» на этой стадии белок.

Как считает Кортни Парк (Courtney Parke), аспирант и автор статьи, с успехом провести такое действие очень сложно. Прежде чем ученые смогли этого достичь, только три попытки оказались удачными. И, тем не менее, успех нельзя было назвать полным, так как не удалось показать, как происходит первый шаг в разрыве АТФ.

Другим осложняющим обстоятельством было то, что чистый кинезин обычно связан с продуктом распада АТФ – аденозиндифосфатом, или АДФ.

«Мы решили, что вряд ли нам удастся вставить молекулу, имитирующую АТФ, в этот очищенный белок с уже связанными с ним молекулами АДФ. Нужно было сначала убрать АДФ. Это то, что белок делает в естественных условиях», - говорит Ким. «Вместо принудительного нарушения нормальной последовательности шагов в расщеплении АТФ мы сначала убрали оттуда АДФ, а затем позволили кинезину связаться с молекулой, имитирующей АТФ. И, о чудо! Мы получили ответ!».

Результат оказался удивительным – исследователи увидели, что для получения энергии реакции белок использует целую цепочку молекул воды.

«Здравый смысл указывал на агент реакции, который запускает процесс распада АТФ, как на что-то в составе белка, например, на аминокислоту», - замечает Эдвард Войцик (Edward Wojcik), доцент и соавтор статьи.

Но это была совсем не аминокислота. Протон у первой молекулы воды отнимала вторая молекула воды!

«Все молекулы воды связаны с разными частями белка. При этом они, как правило, держатся близко друг к другу, соединяя два очень далеких участка белка молекулярным мостом», – объясняет Ким. «Наши данные говорят о том, что, когда вторая молекула воды забирает протон у первой, протон передается по этому мосту. Это заставляет две разные части белка, соединенные мостом, раскручиваться, и мы наблюдаем движение внутри белковой молекулы».

Такое внутреннее движение перемещает белковую наномашину вдоль установленного для нее пути, позволяя выполнять свойственные ей функции.

«Несмотря на относительную простоту молекулы, вода еще многому может нас научить, и я не перестаю удивляться тому, какую важную роль она играет в механизме белкового мотора», - делится своими впечатлениями Войцик.

Ученые надеются, что ясное понимание принципов работы таких биологических машин даст исследователям возможность представить, как и почему происходит движение различных молекул внутри клетки, и позволит им выяснить, как включать и выключать различные внутриклеточные процессы с целью создания новых лекарственных препаратов для борьбы с болезнями.

«Мы полагаем, что многие, если не все, белки, использующие энергию расщепления АТФ, функционируют подобным образом», - комментирует Ким.

По материалам Американского общества биохимии и молекулярной биологии (American Society for Biochemistry and Molecular Biology).

Оригинал статьи

Researchers determine how ATP, molecule bearing 'the fuel of life,' is broken down in cells

Ученые изучают поведение белков в живой клетке в реальном времени

Новая технология изучения динамики белков в живых клетках создана группой ученых из Университета Иллинойса (University of Illinois), и данные, полученные с помощью нового метода, указывают на то, что микроокружение в живой клетке сильно меняет стабильность белков и скорость их фолдинга. Исследование опубликовано в журнале Nature Methods.

Профессор химии из Университета Иллинойса и автор статьи Мартин Грубель (Martin Gruebele) говорит, что метод, разработанный им и его коллегами, впервые позволяет проследить за сборкой и денатурацией белков в реальном времени не в лабораторной пробирке, а в живой клетке.

«Это первый эксперимент, позволяющий нам видеть динамику фолдинга белков в живой клетке», - говорит Грубель. «Теперь у нас есть возможность наблюдать динамику быстрых биологические процессы в реальном времени».

Для изучения биомолекулярной динамики внутри живой клетки Грубель и его группа впервые применили гибридный метод, названный ими «Визуализацией быстрой релаксации» (Fast Relaxation Imaging), объединяющий в себе флуоресцентную микроскопию и температурный анализ, то есть анализ резких температурных скачков.

«Этот инструмент исследования объединяет два мира: химическую динамику и возможность изучать реакции в реальном времени и биологическое микроокружение, в условиях которого биологи наблюдают, как реакции протекают в клетках», - объясняет Грубель.

Для получения быстрых температурных скачков используются точные лазерные импульсы. Клетки обычно нагреваются до 96-100 градусов по Фаренгейту (35.6 – 37.8 по Цельсию). «Это напоминает картину небольшой лихорадки, но в клеточном масштабе», - сравнивает Грубель. Для наблюдения и записи того, что происходит в клетке, используется инвертированный флуоресцентный микроскоп. Продолжительность наблюдаемого процесса составляет несколько миллисекунд.

Грубель поясняет, что хотя методика температурных скачков уже достаточно давно используется для изучения кинетики химических реакций in vitro, этот метод органичен «кинетикой в гомогенной среде», или невозможностью увидеть динамику в различных частях живой клетки.

«Мы не могли изучать динамику, наблюдать, как изменяется химическая реакция, такая, например, как фолдинг белка внутри живой клетки», - говорит он. «При резких перепадах температуры и давления эти эксперименты можно провести очень быстро, но нельзя получить изображение, позволяющее увидеть, происходит ли фолдинг белков в одной части клетки быстрее, чем в другой».

С другой стороны, флуоресцентная микроскопия позволяет ученым увидеть клетку изнутри, но не позволяет исследователям изучать динамику и кинетику процессов.

«С помощью флуоресцентной микроскопии мы можем получить изображения клеток и их внутреннего строения, но не можем видеть, как что-либо быстро меняется в них во времени. Получается, что мы можем наблюдать в лучшем случае за самими медленными динамическими процессами. Наши эксперименты объединили эти два аспекта», - продолжает ученый.

Так как биомолекулярная динамика в большинстве случаев исследуется in vitro, а результаты экспериментов затем экстраполируются на процессы, протекающие в живых клетках, Грубель считает, что новая методика позволяет получить некоторые интересные данные, которые могут изменить стандарты мышления в этой области.

«Если эксперименты проводятся только в искусственном микроокружении, таком как лабораторная пробирка или неживая клетка, вы получите один ответ», - говорит Грубель. «Это воспроизводимое микроокружение, и поэтому мы получаем один и тот же ответ. Если же мы работаем непосредственно в живой клетке, в разных ее частях ответы будут разными».

Использование новой методики позволило прийти к выводу, что белки, находящиеся в живой клетке, более стабильны, а их температурная денатурация и кинетика фолдинга медленнее, чем у тех же белков in vitro.

В живой клетке «мы действительно сталкиваемся с большой гетерогенностью - значительными различиями между частями клетки. В одних частях белки проявляют большую стабильность, в других же они очень нестабильны. В клетке есть места, где фолдинг белков протекает очень быстро, и места, где этот процесс идет очень медленно».

Причина такой высокой гетерогенности заключается в том, что белки должны проложить себе путь через любые доступные им каналы. И, в противоположность микроокружению в пробирке, в живой клетке они испытывают сопротивление со стороны множества других клеточных структур.

“При изучении белков in vitro мы имеем дело с очень простым, очень гомогенным микроокружением. В живой клетке 30-40% компонентов представляют собой твердые субстанции. Среди них и крупные, такие как рибосомы, и преграды, такие как клеточные мембраны, и все более мелкие и мелкие части – другие белки и сахара. Это по истине огромная система из структур разных размеров, через которую белок должен пройти по своему пути, и которая может препятствовать его свободному проходу и взаимодействию, в отличие от того, как это происходило бы при сборке и денатурации в искусственном микроокружении. Таким образом, микроокружение, а не внутренние свойства самого белка, определяет все те вариации, которые мы наблюдали».

В дополнении к возможности выяснить внутреннюю клеточную динамику, считает Грубель, методика визуализации быстрой релаксации будет иметь и практическое применение в медицине.

«Используя новую методику, мы сможем наблюдать, как протекают во времени быстрые биологические процессы, в том числе и патологические, особенно при неврологических заболеваниях, вызывающих деменцию, таких как болезни Альцгеймера, Хартингтона, Кройцфельдта-Якоба», - утверждает ученый. «Потенциально мы даже сможем воспроизводить такие процессы и изучать их динамику в экспериментах на животных».

«Мы можем взять интересующие нас белки, ввести их в тот вид клеток, где они вызывают заболевание, подвергнуть тепловому шоку и увидеть, не связываются ли они каким-либо неправильным образом с мембранами и не повреждают ли их. Мы сможем проследить за этими событиями в реальном времени и дать заключение, не является ли все это возможной причиной заболевания».

По материалам University of Illinois at Urbana-Champaign.

Оригинал статьи

New Technique Allows Study of Protein Folding, Dynamics in Living Cells